Несколько слов о "хампинологии". Думаю, стоит задуматься, когда я начал заниматься изучением этого белка и каковы мои успехи на этом поприще.
Насколько я помню, все началось с того, что летом 2003, будучи студентом (после 5го курса, а у нас в институте их 6) я участвовал в подаче заявки на грант CRDF, посвященный новому белку млекопитающих, который назвали "хампином" (предполагалось, что поскольку он взаимодействует с белком бета-М в бактериальной двугибридной системе, и он - единственный ее партнер, то может быть, что хампин - "молекулярный шаперон" бета-М и не дает ей сортироваться в плазматическую мембрану, мешает, так сказать - to hamper). Методы и подходы, предлагавшиеся тогда в проекте, меня вдохновили и я тоже решил по мере возможности заниматься изучением хампина ("новый регулятор мембранного транспорта"). Было решено, что я здесь (в Москве) буду проводить часть экспериментов - совместно с моей тогдашней студенткой (А. Г.), а другая часть - будет выполняться в штатах, где работал тогда временно мой руководитель.
В наши с А.Г. планы входило изучить первичную структуру хампина мыши, получить к нему антитела, детектировать в тканях и проверить внутриклеточную локализацию (в общем, все стандартно). Чем "мы" и занялись.
-к концу 2003 года я стал разбираться с первичной структурой, копаясь в базах данных нуклеотидных последовательностей (для меня это тогда было в первый раз). В то же время, в штатах хампин был запущен в двугибридный скрининг, но уже дрожжевой - с целью идентификации его физиологических партнеров и т.п.
-2004 год принес печальные вести - оказалось, что вряд ли хампин является партнером бета-М в физиологических условиях. В то же время, я (совместно с А.Г.) уже провел RT-PCRs, выявишие хар-р экспрессии всех (пяти) изоформ хампина в тканях мыши и разобрался с его альтернативным сплайсингом. Более того, уже был получен рекомбинантный препарат фрагмента белка, который использовался для иммунизации и получения антител. Делались уже первые блоты (тогда безуспешные) и просто так бросать тему было поздно. Чудом удалось сварганить статью в журнал "Биоорганическая химия" (вышедшую примерно год спустя благодаря расторопности редакции данного издания). Ближе к концу года я даже попытался получить моноклональные антитела к хампину (зачем - сейчас затрудняюсь ответить) и (в YTH) был выявлен ряд новых партнеров хампина. Самое главное, - выяснилось, что хампин является отдаленным гомологом белка дрозофилы MSL1 - важного компонента комплекса MSL, участвующего в регуляции структуры хроматина.
-2005 год - скрининги в YTH подходили к концу и была выявлена пока гипотетическая схемка белковых взаимодействий хампина. Было решено подтвердить взаимодействия, используя связывание in vitro, ко-иммунопреципитацию из интактной ткани... и т.п. (смотря что получится). Параллельно была поставлена задача сделать химеры всех изоформ хампина с GFP и сравнить их внутриклеточную локализацию. Это удалось сделать к концу 2005, а вот партнеры... пара получилась сразу (TTC4 & NOP17), как рекомбинантные фрагменты, а один очень упорно не получалось даже клонировать. К концу года были получены антитела на TTC4 & NOP17 и выяснилось, что С-концевой домен хампина (который должен с ними взаимодействовать) - нерастворим при экспрессии в бактериях. Вестерн-блотинг клеточных лизатов позволил детектировать хампин, но... оказалось, что данный белок достаточно лабилен и вряд ли эксперименты по ко-преципитации получатся (так и оказалось).
-2006 год. Пожалуй, наиболее удачный (совершенно неожиданно). Столкнувшись с рядом проблем, возникающих при экспрессии большого кол-ва белков в бактериях, мы решили создать новую систему белковых "тегов". Несмотря на достаточно большой срок, что это у меня заняло (около полугода), теги D1HTH, CBD и HPML оправдали себя. Во-первых, впервые удалось продуцировать полноразмерные варианты хампина в бактериях и, как следствие, я использовал эту опцию для подтверждения ряда взаимодействий (всех, что смог), в которые вовлечен хампин. С помощью иммуноцитохимии удалось ко-локализовать два малоизученных партнера хампина с ним в клетке (см. прошлые посты). Ну и об остальном я уже вроде писал.
Теперь возникает вопрос - достаточно ли этой работы для диссертации? Сложно оценивать себя самого, конечно. По идее, да - вот неизвестный белок, я изучил его первичную структуру, содержание в организме, подотделах клетки, а также подтвердил его взаимодействия с рядом белков, которые тоже попутно пришлось охарактеризовать. Но... функция то где? Пусть даже и не для диссера, но для себя, для логического завершения этой работы хотелось бы подтвердить функциональную значимость хоть какого-нибудь "нового" взаимодействия.
Комментариев нет:
Отправить комментарий